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生物物理學(xué)技術(shù)在當(dāng)今科研生產(chǎn)領(lǐng)域有著非常廣泛的應(yīng)用，涉及到的學(xué)科更是包括了化學(xué)、生物學(xué)、材料學(xué)、藥學(xué)等等多學(xué)科門類。應(yīng)用生物物理學(xué)技術(shù)往往能從另一個角度突破原有專業(yè)知識局限挖到意想不到的寶貝。本君一直從事新藥發(fā)現(xiàn)相關(guān)研究，但是長期以來受困于活性化合物的靶標(biāo)尋找與確認(rèn)。藥靶確認(rèn)是新藥發(fā)現(xiàn)過程中的一個重要環(huán)節(jié)。特別是對于多靶點作用的天然產(chǎn)物以及基于表型篩選得到的各種活性化合物，確認(rèn)藥靶成為了活性化合物和臨床候選藥物之間一道難以逾越的鴻溝。以往，這部分工作更多依賴于各種生物化學(xué)方法。近幾年，大量生物物理學(xué)技術(shù)手段被廣泛應(yīng)用于活性化合物的靶標(biāo)確認(rèn)環(huán)節(jié)，這在某種程度上加速了新藥開發(fā)的速度，也為更多活性天然產(chǎn)物的成藥開發(fā)掃清了關(guān)鍵技術(shù)屏障。隨著自己對各種生物物理學(xué)技術(shù)的了解和應(yīng)用，深感其在藥靶確認(rèn)環(huán)節(jié)中大有用武之地。今天，就為大家介紹藥靶確認(rèn)環(huán)節(jié)中使用較為廣泛的幾種生物物理學(xué)技術(shù)，算是端午節(jié)的福利吧。

藥“靶”確認(rèn)是新藥發(fā)現(xiàn)的重要環(huán)節(jié)。圖片來自網(wǎng)絡(luò)

1. X-Ray Crystallography

眾所周知，X-射線單晶衍射技術(shù)在表征化合物結(jié)構(gòu)中具有舉足輕重的作用。對于生物分子的結(jié)構(gòu)解析，X-射線晶體學(xué)（XRC）同樣占據(jù)重要地位。在藥物研發(fā)過程中，活性化合物與生物分子復(fù)合物的共結(jié)晶（簡稱共晶）結(jié)構(gòu)解析無疑成為了活性化合物藥靶確認(rèn)的強(qiáng)有力武器。

有機(jī)小分子與蛋白質(zhì)的共晶實驗。圖片來源：J. Med. Chem.

優(yōu)勢：能明確化合物關(guān)鍵片段與生物分子直接相互作用的具體結(jié)合位點信息，這是其他技術(shù)所不能提供的。精確到原子級別的相互作用信息可以稱得上是藥物化學(xué)家手中的利劍。

局限：被研究的生物分子要能夠很好地結(jié)晶，并且能獲得化合物與生物分子的共晶。無法對相互作用強(qiáng)度進(jìn)行相對定量。整個研究過程需要大量的生物分子，且實驗周期較長。

2. NMR (Nuclear magnetic resonance)

用于研究小分子有機(jī)化合物和生物大分子相互作用的核磁共振（NMR）技術(shù)有許多，比如STD-NMR，Water-LOGSY，1H/13C-HSQC，1H/15N-HSQC等等。總的來說，可以分為兩大流派。一派是通過大分子NMR信號變化確認(rèn)相互作用形式（1H/13C-HSQC，1H/15N-HSQC等），另一派則是通過檢測小分子NMR信號變化確認(rèn)相互作用形式（如STD-NMR，Water-LOGSY等）。

2D 1H/15N HSQC NMR。圖片來源：Nat. Rev. Drug. Discov.

STD-NMR分析人血清白蛋白和硝西泮類似物。圖片來源：J. Chem. Educ.

優(yōu)勢：基于大分子的NMR檢測能解析出生物大分子的結(jié)構(gòu)，通過滴定實驗計算出小分子與生物大分子結(jié)合強(qiáng)度Kd值；基于小分子的NMR檢測能明確小分子哪個結(jié)構(gòu)片段與生物大分子存在相互作用，對生物分子的大小無要求，更不需要對其進(jìn)行同位素標(biāo)記。

局限：基于大分子的NMR檢測大多需要對蛋白進(jìn)行大量13C和（或）15N的同位素標(biāo)記，通常適用于分子量小于40 kDa的小蛋白；基于小分子的NMR檢測有時則會受制于小分子的結(jié)構(gòu)而無法應(yīng)用。

3. SPR (surface plasmon resonance)

如果說上述兩項技術(shù)是在研究小分子結(jié)構(gòu)信息的基礎(chǔ)上拓展而來，那么表面等離子共振（SPR）技術(shù)似乎就是為研究大分子而生，該技術(shù)在研究生物大分子之間相互作用領(lǐng)域中有著不俗表現(xiàn)。就目前發(fā)展而言，檢測小分子與生物大分子的SPR技術(shù)也可分為兩種流派：一派是基于微流體表面感受器的檢測技術(shù)（固定生物大分子）；另一派是基于微陣列感受器靠CCD相機(jī)成像的檢測技術(shù)（固定小分子化合物庫）。

基于微流體表面感受器的SPR實驗。圖片來源：Cell

基于微陣列感受器的SPR實驗。圖片來源：Nat. Rev. Drug. Discov.

優(yōu)勢：基于微流體表面感受器的SPR技術(shù)可以直接進(jìn)行和時間相關(guān)的各種檢測，比如測定Kd，kon，koff的具體數(shù)值；基于微陣列感受器的SPR技術(shù)則具有超高通量的優(yōu)勢，無論哪種SPR技術(shù)，它們都可以進(jìn)行化學(xué)計量學(xué)研究（也就是一個靶點結(jié)合幾個活性化合物），并且靈敏度都非常高足以滿足目前各種常規(guī)檢測。

局限：第一種SPR技術(shù)需要固定生物分子到芯片上，固定過程中會導(dǎo)致部分失活，對于一些穩(wěn)定性較差的生物分子難以應(yīng)用這種方法；第二種SPR技術(shù)需要固定化合物庫到感受器上因此需要對化合物進(jìn)行特定的共價修飾。

4. ITC (Isothermal titration calorimetry)

等溫滴定量熱（ITC）技術(shù)能夠測量生物分子與配體之間相互作用時的熱量改變。因其能測得分子間相互作用的各種熱力學(xué)常數(shù)（ΔH，ΔS，ΔCP），Kd值以及化學(xué)計量學(xué)結(jié)果被許多科研人員奉為驗證分子間直接相互作用的“金標(biāo)準(zhǔn)”。

ITC實驗結(jié)果。圖片來源：J. Med. Chem.

優(yōu)勢：生物大分子和化合物均不需要任何化學(xué)修飾，量熱過程完全在溶液中進(jìn)行，實驗結(jié)果直接反映分子間相互作用熱力學(xué)情況，結(jié)果可靠性高。

局限：生物大分子消耗巨大！巨大！巨大！許多研究人員抱怨滴定小分子與蛋白作用時產(chǎn)熱太小…太小…太小……

上述四大技術(shù)可稱得上是藥靶確認(rèn)過程中應(yīng)用相對廣泛的生物物理學(xué)技術(shù)。除此之外，還有一些相對小眾的技術(shù)手段用于確認(rèn)藥靶，比如TSA（Thermal shift analysis）、DSC（Differential scanning calorimetry），質(zhì)譜技術(shù)中的NC?MS（Non-covalent MS）、AS?MS（Affinity-selection MS）、HDX?MS（hydrogen–deuterium exchange MS）等等。由于篇幅所限，就不在這一一列舉了。

在藥物研發(fā)過程中，這些生物物理學(xué)技術(shù)除了應(yīng)用于靶標(biāo)確認(rèn)，在基于片段的藥物發(fā)現(xiàn)（fragment-based drug discovery，F(xiàn)BDD）領(lǐng)域更是有著不俗的表現(xiàn)，這方面的報道很多，我也就不在此贅述了。

希望大家通過我的介紹對這些技術(shù)有所了解，也許將來再解決某個問題時腦中能閃過一道光影，然后拿出手機(jī)找到這篇文章。至少，在讀文獻(xiàn)時看到上面的類似配圖不至于一臉茫然。

最后，歡迎用過上述某個技術(shù)的同學(xué)積極踴躍留言。畢竟本君水平有限，難免有錯漏之處，大家多多交流哦。

參考文獻(xiàn)：

1. Biophysics in drug discovery: impact, challenges and opportunities. Nat. Rev. Drug. Discov., 2016, 15, 679-698

2. The Practice of Medicinal Chemistry 3rd.